导 读

以华北寒冷地区某典型城镇污水处理厂CASS工艺为研究对象，对污水处理厂不同季节活性污泥样品进行微生物分析，考察不同季节活性污泥的群落结构变化，探究脱氮效果与氮转化功能基因赋存的相关性。结果显示，秋冬季节，Bacteroidetes相对丰度上升至31.45%和30.47%，冬季CASS池内Methylotenera(12.94%)、Zoogloea(8.74%)、Dechloromonas(2.15%)、Arcobacter(7.43%)、Thauera(2.11%)、Pseudomonas(0.43%)共占已知微生物菌属的33.80%。由微生物结果可以看出，春夏季节过渡到秋季稳定运行，冬季时期系统内反硝化细菌均有大幅增加。本研究对生物脱氮系统中的菌群结构和多样性做了系统分析，可为优化寒冷地区城镇污水处理厂脱氮效果提供理论基础。

引用本文：柳蒙蒙，陈亚松，魏源送，等. 寒冷地区城镇污水处理厂氮转化功能菌群和功能基因季节变化特征分析［J］. 给水排水，2023，49（10）：38-43，52.

01  材料与方法

1.1 污水处理厂概况

河北省张家口市某城镇污水处理厂采用CASS工艺，设计处理规模1.5万m³/d，实际处理规模8 000~12 000 m³/d，执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002）一级A标准，2009年7月投入运行。污水处理厂进水水质COD、氨氮、总氮、BOD5浓度分别为(400±50)、(70±10)、(80±10)和(160±20) mg/L。其工艺流程如图1所示。

图1   污水处理厂CASS工艺流程

1.2 高通量测序

本研究于2020春季(3月)、夏季(6月)、秋季(10月)和冬季(12月)，从稳定运行的CASS工艺生物反应池内取出2 mL活性污泥，10 000 r/min离心10 min，去上清液。为减小误差，每种样品进行4个平行提取，然后将4份DNA样品混匀。样品基因组DNA提取使用FAST DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，USA)试剂盒，按照产品说明对样品基因组DNA进行提取。DNA提取效果通过琼脂糖凝胶电泳(1×TAE缓冲溶液，2%凝胶浓度)确定。

PCR扩增所用引物为515f(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806r(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，扩增子长度约290 bp。正向引物前加不同的barcode以区别不同样品，每个样品重复3次PCR，进行混匀和切胶回收。来自不同样品的PCR 产物等量混匀，进行建库和测序，建库测序交由上海生工生物工程股份有限公司完成，高通量测序使用平台为Illumina Miseq platform(Illumina，USA)。

1.3 荧光定量PCR (qPCR)分析

采用荧光定量PCR(qPCR)对样品中的细菌总量、氮转化功能基因进行定量测定。测定的氮转化功能基因包括硝化过程、反硝化过程、厌氧氨氧化过程涉及的相关功能基因(序列和退火温度等参照文献)。本研究定量PCR在ABI real-time PCR system 7500 (ABI，USA)上进行，通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析确保qPCR的准确性。

qPCR详细流程如下：首先通过PCR对目标基因进行扩增，将扩增产物进行切胶回收，通过TA克隆构建带有目标基因的质粒载体作为标准品，用于标准曲线的制作。将克隆质粒进行10倍梯度稀释，选取5~7个点通过预试验选取合适标准品制备标准曲线。

定量PCR反应体系为40 μL，配置如下：2×TaqMix (0.5 μL)，Primer F (1.0 μL)，Primer R (1.0 μL)，dd H2O (17.5 μL)；配置好的PCR体系按照如下反应条件进行PCR扩增：(1)解链，95 ℃，10 min；(2) 30次循环：95 ℃解链45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；(3)72 ℃延伸5 min。

02 结果与讨论

2.1 污水运行效果

污水处理厂水质参数如下表1(以当月每日进出水水质数据计算平均值和标准差)所示。可以看出，该厂在秋季、冬季进水水温逐渐降低，最低可达8.0℃左右，出水各指标可稳定在一级A排放标准内。

表1   污水处理厂典型季节主要进出水水质参数

2.2 污泥中微生物多样性分析

Alpha多样性分析用来研究细菌群落的丰富度和多样性, 包括Shannon、Chao、Ace、Simpson、Coverage等统计学分析指数，多样性指数均根据序列相似度97%计算。该污水处理厂不同季节微生物多样性指数如表2所示。

表2   污水处理厂不同季节样品多样性α指数

4个样品的覆盖率(Converage)均在99%以上，说明此次测序已检测出污泥中绝大多数微生物，覆盖群落多样性，可以真实反应污水处理厂污泥中细菌群落结构。其中，4个季节样品中观察到的物种数目分别为1 628，2 061，2 528，2 239，说明秋冬季节微生物物种数量最多。Chao指数和ACE指数可用来估计群落丰富度，样品中秋冬季节的指数均高于春夏季节。Shinnon指数和Simpson指数表征样品中微生物多样性，二者均表明秋冬季节具有更高的微生物多样性。

2.3 系统微生物群落结构分析

活性污泥中门水平上群落结构的变化如图2所示。可以看出四个季节CASS工艺生化处理系统中优势菌群均为变形菌门微生物，变形菌门是一类兼具反硝化和除磷能力的微生物，在厌氧阶段和缺氧阶段分别发挥释磷和脱氮作用。春季污泥群落结构中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)占主要优势，相对丰度分别为65.66%和27.82%。同时，夏季污泥群落结构呈现出一定的变化，微生物多样性变大，Proteobacteria和Bacteroidetes仍然占主要优势，Proteobacteria相对丰度为67.41%，Bacteroidetes相对丰度下降至17.35%，Verrucomicrobia相对丰度上升至6.09%，出现一定量的浮霉菌门(Planctomycetes)(1.96%)和酸杆菌门(Acidobacteria)(1.93%)。

注：样品名为“厂名.采样季节”，如PW.sp代表污水处理厂春季样品

图2   不同季节样品门(phylum)水平群落结构变化

随着进水温度逐渐降低，即秋冬季节，污泥生物多样性进一步增加，优势种群增多，整体结构更加平衡，可保证总氮达标排放。秋季和冬季污泥群落结构具有一定相似性，秋季过渡到冬季期活性污泥系统中变形菌门的菌群增值幅度接近5%，说明冬季温度降低使得系统中出现了适应低温情况下生长的能够维持活性污泥系统稳定运行的变形细菌。Bacteroidetes相对丰度上升至31.45%和30.47%，说明温度降低，在秋冬季节系统的硝化能力提高了，反映在水质上是出水氨氮浓度的降低。Acidobacteria相对丰度分别上升至3.68%和2.24%，出现一定量的Firmicutes(2.62%~2.92%)和Actinobacteria(1.71%~2.15%)。

从属水平来看(见图3)，与反硝化有关的菌属主要有Methylotenera、Zoogloea、Dechloromonas、Arcobacter、Thauera、Pseudomonas。秋季CASS池内Methylotenera(7.30%)、Zoogloea(2.17%)、Dechloromonas(1.29%)、Arcobacter(3.77%)、Thauera(0.84%)、Pseudomonas(0.37%)共占已知微生物菌属的15.74%，冬季CASS池内Methylotenera(12.94%)、Zoogloea(8.74%)、Dechloromonas(2.15%)、Arcobacter(7.43%)、Thauera(2.11%)、Pseudomonas(0.43%)共占已知微生物菌属的33.80%。由微生物结果可以看出，春夏季节过渡到秋季稳定运行，冬季时期系统内反硝化细菌均有大幅增加。

图3   不同季节样品细菌菌属水平群落结构变化

2.4 活性污泥中氮转化功能基因的赋存特征

不同季节样品中氮转化功能基因拷贝数和相对丰度如图4所示。结果显示，执行硝化作用的功能基因拷贝数由小到大为amoA<nxra <hao="" <nxrb<="" span="">，其拷贝数分别为(4.63±0.69)、(4.89±0.66)、(5.96±0.40)、(7.48±0.43)个log，执行反硝化作用的功能基因拷贝数由小到大为nirK<norb <narg="" <="" nosz="" <nirs<="" span="">，其拷贝数分别为(5.56±0.49)、(6.97±0.87)、(7.83±0.41)、(8.22±0.23)、(8.46±0.48)个log。污水处理厂在春夏季节，温度相对比较高，功能基因丰度的分布差距较大，特别是nirS和nosZ，占总丰度的85%以上，其他功能基因的丰度占比较小，夏季功能基因丰度高于春季；进入秋冬季节，进水水温下降明显，功能基因的总丰度有所下降，但各基因的分布趋于平衡，nxrB、narG、norB的丰度占比都大大增加，从功能基因角度看多样性有所增加，系统稳定性有所增强。温度对基因丰度的影响只体现在对总丰度上，并未对基因分布结构产生影响。

图4   不同季节样品氮转化功能基因拷贝数和相对分布

2.5 氮转化功能菌群和功能基因转归分析

脱氮效果与活性污泥群落结构(属水平)和氮转化功能基因赋存的相关性网络分析如图所示，点与点之间的联系代表基于Spearman相关性分析的正相关关系，点越大代表相关数量越多。氮转化功能基因与某些菌属存在显著正相关关系，网络结构分析更直观地展示了脱氮效果、活性污泥群落结构和功能基因之间的关系。菌属的功能标注来源于菌属在LPSN的原始文献见图4和图5。

图5   基于Sperman分析的脱氮效果与活性污泥群落结构(属水平)及功能基因的相关性网络分析

典型氨氧化菌属Nitrosomonas与氨氧化过程功能基因amoA和hao存在显著相关关系，典型硝化菌属Nitrospira与硝化过程功能基因nxr存在相关关系，这表明了功能菌群和功能基因间的联系。与此同时，氨氧化过程功能基因hao、硝化过程功能基因nxr、反硝化过程功能基因narG和nosZ与多种菌群如Prosthecobacter、Polyangium、Chryseolinea、Dokdonella等存在相关关系，显示了功能菌的多样性，很多菌属可能是潜在的氮转化功能菌属。污水氨氮去除率(ARE)和总氮去除率(NRE)均与多种氮转化功能基因如nxr、narG和nosZ呈正相关关系，表明使用功能基因的赋存特征来表征处理效果具有一定的可信度。

03 结 论

（1）宏基因技术检测污泥生物脱氮群落的特性，分类表明活性污泥具有较好的物种多样性，能较好地支撑污水处理厂处理的性能；秋冬季节，温度降低使得系统中出现了适应低温情况下生长的能够维持活性污泥系统稳定运行的变形细菌；

（2）污水处理厂在全年稳定运行过程中，随着进水水温的降低，即春夏季节到秋冬季节转化过程中，活性污泥微生物群落的生物多样性及脱氮功能菌群和功能基因的丰度有所提高，而污泥物种多样性较高可能使污泥具有较高的稳定性，能够更好地抵抗温度和污染物浓度变化带来的冲击。

（3）脱氮效果与活性污泥群落结构和氮转化功能基因赋存的相关性网络分析表明，部分菌种与功能基因存在正相关关系，显示了功能菌的多样性，很多菌属可能是潜在的氮转化功能菌属；

（4）本研究探讨了不同季节活性污泥系统中微生物菌群多样性和功能多样性，对深入理解活性污泥的微生物菌群结构与温度之间的关系具有重大意义；同时本研究对生物脱氮系统的菌群群落和多样性做的综合理解，为提高小城镇污水处理厂的运行效果提供理论支撑，可为生物脱氮系统提供优化运行的技术支持。

（来源：给水排水）